Detección in situ de Salmonella spp. mediante la reacción en cadena de la polimerasa por convección e inmunoensayo de flujo lateral de ácido nucleico

Resumen

El género Salmonella está integrado de bacilos Gram negativos perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, a este género pertenecen algunos patógenos zoonóticos que representan una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La Salmonella enterica serotipo Enteriditis y Salmonella enterica serotipo Typhimurium, se encuentran con frecuencia en alimentos contaminados, especialmente en la carne, y se consideran los dos serotipos más importantes de Salmonella transmitida de animales a seres humanos en la mayor parte del mundo, ya que son causantes de la enfermedad llamada salmonelosis. Es importante realizar un buen control en la contaminación microbiana de los alimentos, para disminuir las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA´s), para esto se necesitan métodos de detección rápidos y sensibles, realizando un seguimiento eficaz de los microorganismos patógenos, específicamente la Salmonella. En la actualidad se han empleado métodos de tipo molecular rápida y sensible que es la PCR por convección (cPCR). Aunado a esto se han desarrollado dispositivos de ensayo de flujo lateral de ácidos nucleicos (NALF), que permite una detección indirecta de los productos de PCR amplificados mediante el uso de anticuerpos contra etiquetas de oligonucleótidos específicos, como la carboxifluoresceína (FAM), la digoxigenina (DIG) y la biotina. El objetivo de este estudio es estandarizar un método rápido y sensible para la detección in situ de Salmonella spp., mediante la combinación de cPCR y el inmunoensayo NALF. Se realizó la extracción de ADN genómico de la cepa control de Salmonella enterica ATCC 14028, usando un extractor portátil de ácidos nucleicos Palm Tron™ E1, (Ahram BIOSYSTEM), y se siguió la metodología del fabricante. La concentración y pureza del ADN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000c, se evaluó la integridad mediante un gel. La cPCR se realizó en un volumen de 20 microlitro, conteniendo 4 uL de 5X PalmTaq™ Express Mastex mix (suplementada con 2.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP´s, y 0.8 U Taq Polimerasa) (Ahram Biosystems, Part No. RK2010) y 1 uL de cada oligonucleótido (10 µM cada uno) marcados con biotina y fluorescencia, respectivamente y se utilizó 1 µL de ADN genómico. Se realizó en un termociclador portátil PALM PCR (Mod. G3, Ahram Biosystem). La velocidad utilizada fue turbo 3 (T3) con una temperatura de anillamiento de 58°C y 35 ciclos (11 minutos). Se determinó la especificidad de los oligonucleótidos en nueve diferentes muestras de ADN genómico (Salmonella ATCC 14028, Listeria innocua ATCC 33091, Listeria ivanovii ATCC 19119, E. coli O157:H7-CIBNOR (cepa H28-1), E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Staphylococcus aureus ATCC 29213). La sensibilidad del ensayo se determinó mediante el promedio del tamaño del genoma en pares de bases, usando 5 cepas de Salmonella (ATCC 14028, ATCC 35640, ATCC BAA1715, ATCC BAA1585, ATCC BAA1582), se realizaron diluciones seriadas partiendo de 10⁶ hasta 10⁰ y a cada dilución se le realizó un cPCR. Los productos de cPCR fueron analizados con una electroforesis en gel de agarosa, y simultáneamente se utilizó el inmunoensayo NALF (Nucleic Acid Lateral Flow) (Ahram Boisystems). Como resultado se obtuvo la estandarización con los oligonucleótidos específicos para detectar Salmonella spp. La sensibilidad para la cPCR, fue de 3.753 x 10³ en el gel de agarosa al 1%, sin embargo, al momento de revelarlo con los bioensayos NALF, se observó una línea roja tenue en 3.753x10². En este estudio se estandarizó la detección de Salmonella spp., por el método de cPCR a una velocidad de 11 minutos, con una sensibilidad de detección de 375 copias de ADN genómico, complementado con la detección rápida (5 minutos) por medio de bioensayos NALF, es una herramienta molecular que puede ser aplicada en industrias alimentarias, por su fácil manejo, rapidez y sensibilidad del método.